Mechanizm kontrolujący rozmieszczenie wewnątrzjądrowe topoizomerazy I


dr hab. Agnieszka Girstun


Informacje podstawowe.

Moje zainteresowania badawcze koncentrują się aktualnie wokół zagadnień związanych z przemieszczaniem białek na terenie jądra komórkowego. Celem projektu, nad którym pracuję, jest wyjaśnienie mechanizmu decydującego o lokalizacji wewnątrzjądrowej ludzkiego enzymu topoizomeraza I (topo I) w warunkach fizjologicznych i w odpowiedzi na lek przeciwnowotworowy, kamptotecynę (CPT).
Projekt jest realizowany we współpracy z prof. dr. hab. Krzysztofem Staroniem i dr. Takao Ishikawą. W pracach nad projektem biorą także udział magistranci i licencjaci Zakładu Biologii Molekularnej.


Stacks Image 30
Opis projektu.

Białka na terenie jądra komórkowego znajdują się w ciągłym ruchu. W uproszczeniu mówiąc, to co obserwujemy, jako koncentrację w określonym przedziale wewnątrzjądrowym, wynika ze spowolnienia ruchu białka w danym miejscu na skutek oddziaływania z innymi elementami jądrowymi. W tym kontekście topo I jest bardzo interesującym białkiem, ponieważ o jej lokalizacji decyduje kilka sumujących się czynników, w tym jej aktywność(ci) katalityczna(e), nieenzymatyczne oddziaływania międzybiałkowe i/lub wiązanie DNA, a rozmieszczenie zależy dodatkowo od wzoru modyfikacji posttranslacyjnych. Topo I jest wyjątkowym enzymem posiadającym dwie zupełnie różne aktywności katalityczne, katalizuje relaksację superheliksu DNA i fosforylację białek SR (ang. serine/ arginine rich). Aktywność relaksacyjną topo I specyficznie hamuje roślinny alkaloid kamptotecyna (CPT), której pochodne są stosowane jako leki przeciwnowotworowe. W odpowiedzi na CPT topo I ulega gwałtownej delokalizacji z jąderek do nukleoplazmy. Projekt jest poświęcony kompletnemu opisaniu mechanizmu decydującego o rozmieszczeniu wewnątrzjądrowym topo I w komórkach interfazowych w stanie fizjologicznym oraz jego zmian po zadziałaniu leków nowotworowych z grupy kamptotecyn.

Metody.

Podstawowe podejście eksperymentalne opiera się na analizie lokalizacji wewnątrzjądrowej badanych białek wyrażanych w komórkach HeLa w fuzji z białkami fluorescencyjnymi (mikroskopia konfokalna). Analizowane są zarówno białka dzikie, jak i ich mutanty. Stosujemy także wyciszanie ekspresji genów metodą siRNA i shRNA. Badaniom mikroskopowym towarzyszą kontrolne analizy metodą Western Blot. Doświadczenia wykonywane są przy użyciu hodowlanych linii komórek człowiek, takich jak HeLa, PC3, LNCaP, a w niektórych wypadkach uzupełniane przez badania wykorzystujące białka rekombinowane, oczyszczane z różnych systemów ekspresyjnych (bakteryjne, rzadziej drożdżowy i bakulowirusowy). Prowadzimy analizy właściwości katalitycznych topo I i jej mutantów, wykorzystując test relaksacji superhelikalnego DNA, fosforylacji z użyciem znakowanego ATP, nacinania DNA oraz badamy oddziaływania międzybiałkowe (technika GST-pull down, immunoprecypitacja).
© 2003-2020 Zakład Biologii Molekularnej UW