logo Uniwersytet Warszawski


Autoreferat rozprawy doktorskiej Pani mgr Joanny Kotwicy Drukuj
poniedziałek, 30 listopada 2009 16:24

„Zegar peryferyczny w męskim układzie rozrodczym Spodoptera littoralis”

Praca została wykonana w Zakładzie Fizjologii Zwierząt Instytutu Zoologii,  Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski pod kierunkiem prof. dr hab. Bronisława Cymborowskiego

Recenzenci:
Prof. dr hab. Marek Maleszewski, Zakład Embriologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Dr hab. Krystyna Grzelak, Zakład Biosyntezy Białka, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

Zegar biologiczny jest mechanizmem, który pozwala organizmom 
na optymalizację przebiegu procesów fizjologicznych w zmieniających się warunkach otoczenia. Generuje on rytmy, które obserwujemy na różnych poziomach złożoności biologicznej – od pojedynczej komórki do grupy organizmów. Sam oscylator regulujący rytmy opiera się na współdziałaniu tzw. genów i białek zegarowych, z których do tej pory najlepiej scharakteryzowanym u owadów jest gen period. Wyniki badań zegara u wielu gatunków zwierząt, a w tym i owadów, stały się podstawą do przyjęcia koncepcji zakładającej istnienie w ich organizmach wielu oscylatorów. Współdziałają one ze sobą, co wyraża się w postaci synchronicznego przebiegu poszczególnych procesów, które znajdują się pod ich kontrolą. Jednym z przykładów takiego mechanizmu, może być system generujący rytm uwalniania plemników z gonad u Lepidoptera, w tym ćmy Spodoptera littoralis. Rytm ten ma cechy charakterystyczne dla rytmu generowanego przez zegar biologiczny, gdyż wykazuje rytmikę dobową w warunkach światło – ciemność (LD) (z możliwością przesunięcia jej fazy po zmianie fotoperiodu), jest zachowany w warunkach stałej ciemności (DD) oraz ulega zaburzeniu w warunkach ciągłego światła (LL). Dowodem na istnienie zegara peryferycznego kontrolującego uwalnianie plemników u S. littoralis są rytmiczne zmiany poziomu zegarowego białka PERIOD, które obserwujemy w górnych odcinkach męskiego układu rozrodczego tego gatunku.

Celem niniejszej pracy była charakterystyka peryferycznego zegara biologicznego zlokalizowanego w męskim układzie rozrodczym Spodoptera littoralis i procesów przez niego kontrolowanych. Zagadnienia rozpatrywane w tej pracy stanowiły odpowiedzi 
na pytania:

  1. Czy rytm uwalniania plemników zależy od ekspresji genu zegara biologicznego period w męskim układzie rozrodczym S. littoralis?
  2. Które spośród glikoprotein produkowanych na terenie początkowych odcinków nasieniowodów S. littoralis produkowane są rytmicznie oraz jaka jest ich charakterystyka?
  3. W jaki sposób są regulowane rytmiczne zmiany pH płynu nasiennego 
w początkowych odcinkach nasieniowodów S. littoralis?
  4. Czy zaburzenie ekspresji genu period w męskim układzie rozrodczym S. littoralis ma wpływ na ekspresję wybranych genów, potencjalnie kontrolowanych przez zegar biologiczny oraz dobowe zmiany ilości kodowanych przez nie białek?

W czasie realizacji wytyczonych celów wykonano szereg analiz, które umożliwiły częściowe scharakteryzowanie zegara peryferycznego w męskim układzie rozrodczym 
S. littoralis. Poniżej przedstawiono skrótowo metodykę oraz najważniejsze wyniki uzyskane w prezentowanej rozprawie doktorskiej.

Używając techniki kontrolowanego zaburzenia ekspresji genów poprzez podawanie dsRNA period S. littoralis do męskich układów rozrodczych S. littoralis hodowanych  in vitro,a następnie badając poziom mRNA period metodą Northern Blot i poziomu białka PERIOD metodą immunohistochemii wykazano, że:

a) molekularny oscylator zlokalizowany na terenie początkowych odcinków męskiego układu rozrodczego S. littoralis funkcjonuje w warunkach in vitro.

b) u S. littoralis oscylator molekularny obecny w komórkach cyst plemnikowych, na terenie jąder, działa według innego mechanizmu, niż oscylator zlokalizowany w komórkach nabłonka tworzącego barierę oddzielającą gonady od nasieniowodów i w nabłonku wyściełającym górny nasieniowód.

c) proces uwalniania plemników z jąder do nasieniowodów u S. littoralis jest zależny od poziomu i lokalizacji komórkowej białka PER w barierze oddzielającej jądro od nasieniowodów.

Stosując rozdział elektroforetyczny białek pochodzących z męskiego układu rozrodczego S. littoralis i znakowanie ich białkami specyficznie rozpoznającymi poszczególne reszty cukrowe wykazano również że:

d) w górnym odcinku nasieniowodu S. littoralis istnieją dobowe zmiany poziomu glikoprotein połączonych z resztami cukrowymi: 
α-D-N-acetylogalaktozaminy, β-D–galaktozy, β (1-3) - D - N – acetylogalaktozaminy, 
α - D-N-acetyloglukozy, kwasu sialowego i α - L – fukozy.

Analiza sekwencji aminokwasowych kilku z badanych glikoprotein przy użyciu spektrometru masowego i określenie fragmentu sekwencji kodującej genu dla jednej z nich niespodziewanie wykazały, że:

e) w gonadach samców S. littoralis produkowane jest białko YP2-like – odpowiednik białka YP2 (ang. Yolk Protein 2), składnika żółtka produkowanego w komórkach folikularnych na terenie owarioli, w związku z tym wykrywanego dotychczas wyłącznie u samic.

Analizy ekspresji genu kodującego białko YP2-like, przy użyciu metody Real Time PCR, a także określenie zmian poziomu YP2-like za pomocą technik Western Blot i immunohistochemicznej pozwoliły stwierdzić, że:

f) rytmiczna produkcja białka YP2-like zależy od fotoperiodu, lecz nie ma cech endogennego rytmu (rytm nie jest zachowany w warunkach stałej ciemności).

g) rytmiczne zmiany poziomu transkryptu i kodowanego przez niego białka YP2-like w gonadach S. littoralis zależą od ekspresji genu per.

h) u S. littoralis białko YP2-like jest przyłączane do plemników na terenie górnego odcinka nasieniowodu oraz wchłaniane z płynu nasiennego przez nabłonek nasieniowodu, przy czym oba procesywykazują cechy rytmu generowanego przez endogenny oscylator (procesy te są rytmiczne w warunkach stałej ciemności).

Podczas badania rytmicznych zmian pH płynu nasiennego początkowych odcinków męskiego układu rozrodczego S. littoralis skupiono się na analizie dwóch enzymów, dla których udowodniono udział w generowaniu odpowiedniego pH dla dojrzewania plemników w męskim układzie rozrodczym ssaków. Wspomniane enzymy to pompa protonowa zależna od ATP (V-ATPaza) i współdziałająca z nią anhydraza węglanowa. U S. littoralis stwierdzono wcześniej, że V-ATPaza powoduje rytmiczne zakwaszenie płynu nasiennego. Analiza ekspresji genów kodujących białka dwóch podjednostek tego enzymu wykazała, że:

i) poziomy mRNA i białek podjednostki domeny cytoplazmatycznej - B 
i podjednostki domeny błonowej - c V-ATPazy, zlokalizowanej w nabłonku wyściełającym górny odcinek nasieniowodu S. littoralis,zmieniają się rytmicznie 
w ciągu doby.

j) ekspresja genu podjednostki B V-ATPazy i produkcja kodowanego przez ten gen białka w nasieniowodzie S. littoralis są niezależne od ekspresji genu per

k) rytmiczne zmiany poziomu transkryptu i kodowanego przez niego białka podjednostki c V-ATPazy w nasieniowodzie S. littoralis zależą od ekspresji genu per.

Badanie aktywności anhydrazy węglanowej w nasieniowodzie S. littoralis pozwoliło wyciągnąć dwa wnioski:

l) aktywność anhydrazy węglanowej jest rytmiczna w ciągu doby w górnym odcinku nasieniowodu S. littoralis i wykazuje cechy rytmu generowanego przez endogenny oscylator (rytm ten jest zachowany w warunkach stałej ciemności).

m) anhydraza węglanowa zlokalizowana w nabłonku górnego odcinka nasieniowodu S. littoralis nie ma wpływu na generowanie rytmicznych zmian 
pH środowiska zewnątrzkomórkowego (medium, w którym hodowane są męskie układy rozrodcze  in vitro).

Podsumowując, można stwierdzić, że na terenie męskiego układu rozrodczego 
S. littoralis znajduje się endogenny oscylator, który reguluje uwalnianie plemników z gonad oraz szereg ściśle z nim związanych procesów rytmicznych.

Część otrzymanych podczas wykonywania pracy wyników weszła w skład publikacji:

  1. Kotwica J., Ciuk M.A., Joachimiak E., Rowinski S., Cymborowski B., Bebas P. Carbonic anhydrase activity in the vas deferens of the cotton leafworm – Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae) controlled by circadian clock. J Physiol Pharmacol. 2006 Nov;57 Suppl 8:107-23.
  2. Bebas P., Kotwica J., Joachimiak E., Giebultowicz J.M. Yolk protein is expressed in the insect testis and interacts with sperm. BMC Dev Biol. 2008 Jun 13;8:64.
  3. Kotwica J., Bebas P., Gvakharia B.O., Giebultowicz J.M. RNA interference of the period gene affects the rhythm of sperm release in moths. J Biol Rhythms. 2009 Feb;24(1):25-34.
 


logo HR