logo Uniwersytet Warszawski


Autoreferat rozprawy doktorskiej Pana mgr Jakuba Mikoszewskiego Drukuj
środa, 28 października 2009 14:29

„Glikolipidy sterolowe w bakłażanie (Solanum melongena L.) – wpływ czynników stresowych na metabolizm oraz enzymatyczne aspekty ich hydrolizy”

Praca doktorska wykonana w Zakładzie Biochemii Roślin Instytutu Biochemii pod kierunkiem dr hab. Jana Zimowskiego

Recenzenci:
Prof. dr hab. Ewa Świeżewska – Zakład Biochemii Lipidów, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
Prof. dr hab. Wiesław Oleszek – Zakład Biochemii i Jakości Plonów, Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa, Państwowy Instytut Badawczy w Puławach

Sterole są związkami powszechnie występującymi w błonach komórkowych, także u roślin. Fitosterole istnieją w formie niezwiązanej (wolne sterole – FS) oraz w postaci złożonych pochodnych glikozydowych (glikozydy steroli – SG), acyloglikozydowych (acyloglikozydy steroli – ASG) oraz estrowych (estry steroli – SE). Prowadzone przez kilka ostatnich dekad badania wykazały, że związki te wyraźnie wpływają na właściwości fizyczne błon komórkowych (sztywność, przepuszczalność) poprzez oddziaływanie z fosfolipidami oraz na aktywność wielu enzymów błonowych. Duże znaczenie dla tych oddziaływań ma także procentowy udział poszczególnych form w składzie sterolowym oraz ich skład jakościowy. Wyniki uzyskane m.in. w Zakładzie Biochemii Roślin pokazują także, że w wielu roślinach poziom poszczególnych form steroli oraz ich skład ulega dynamicznym zmianom podczas kiełkowania i wzrostu rośliny, a także w wyniku działania różnych czynników stresowych. Roślinami często badanymi w naszym Zakładzie były psiankowate (Solanaceae), charakteryzujące się wysoką zawartością glikozydowych pochodnych steroli, co czyni je ciekawym obiektem do tego typu badań. Na przestrzeni ostatnich lat uzyskano szczegółowe wyniki dotyczące biosyntezy złożonych form fitosteroli, natomiast bardzo niewiele wiadomo na temat ich katabolizmu. Mimo dużej liczby doniesień, bardzo fragmentaryczna pozostaje także wiedza na temat wpływu różnych czynników stresowych na poziom, skład i metabolizm poszczególnych form steroli roślinnych.

Celem wykonanych badań było:

  1. Opracowanie wydajniejszej metody rozdziału form glikozydowych (SG i ASG).
  2. Zbadanie wpływu wybranych czynników stresowych (zmiany temperatury, zmiany fotoperiodu) na zmiany składu ilościowego i jakościowego poszczególnych form steroli w siewkach bakłażana (Solanum melongena L.)
  3. Zbadanie wpływu wybranych czynników stresowych (zmiany temperatury, zmiany fotoperiodu) na aktywności enzymów związanych z biosyntezą glikozydowych pochodnych steroli (tj. glukozylotransferazy UDP-Glc:sterol - GT-azy oraz acylotransferazy fosfolipid:sterol - AT-azy) w siewkach bakłażana.
  4. Wyprowadzenie kultury in vitro z siewek bakłażana i oznaczenie zawartości oraz składu jakościowego poszczególnych form steroli w uzyskanej tkance kalusowej.
  5. Zbadanie wpływu wybranych czynników stresowych (kwasu jasmonowego i chitozanu) na zmiany składu ilościowego i jakościowego steroli w tkance kalusowej bakłażana.
  6. Określenie podstawowych właściwości molekularnych i katalitycznych oraz charakterystyka enzymów odpowiedzialnych za deglukozylację glukozydów steroli oraz deacylację acyloglukozydów steroli w siewkach bakłażana.

We wstępnej fazie prowadzonych badań udało się opracować metodę szybkiego rozdziału glikozydowych form steroli z zastosowaniem ekstrakcji na fazie stałej, charakteryzującą się wysoką wydajnością (ponad 90%).

Wykazano także, że abiotyczne czynniki stresowe (temperatura, zmienny fotoperiod) wpływają na aspekt ilościowy składu złożonych pochodnych steroli – wzrasta poziom ASG,a spada SG, czemu towarzyszy podwyższona aktywność transferaz odpowiedzialnych za biosyntezę obu form (GT-azy i AT-azy). Oba czynniki nie wywołują z kolei zmian jakościowych w poszczególnych formach, co wyraźnie różni je od badanych elicytorów biotycznych. W celu zbadania ich wpływu na metabolizm sterolowy wyprowadzono z hipokotyli siewek bakłażana kulturę kalusową, a także oznaczono w niej poziom oraz skład poszczególnych form steroli. Zarówno chitozan (elicytor związany z atakiem patogenów grzybowych) jak i kwas jasmonowy (cząsteczka sygnałowa związana z uszkodzeniem rośliny) wywoływały wyraźne zmiany zarówno w ilościowym, jak i jakościowym składzie form steroli. Wyniki te sugerują, że sterole roślinne są zaangażowane w różnorodną odpowiedź na bardzo odmienne czynniki stresowe, a ich poziom może ulegać zmianie nie tylko ze względu na wzrost rośliny.

W kolejnym etapie badań scharakteryzowano dwie hydrolazy, odpowiedzialne za hydrolizę SG (odłączanie reszty glukozy) oraz ASG (odłączanie reszty acylowej). Glukohydrolaza SG (GH-aza) oraz acylohydrolaza ASG (AH-aza) to enzymy błonowe o względnej masie cząsteczkowej wynoszącej odpowiednio ok. 81 kDa i ok. 68 kDa, stałej Michaelisa równej 5,88 µM oraz 9,09 µM i prędkości maksymalnej0,91pmol x min-1 x mg białka-1 i 2,5nmol x min-1 x mg białka-1. GH-aza jest specyficzna wobec glukozydów steroli (nie hydrolizuje innych glukozydów steroidowych – np. glukozydu solasodyny, glukozydów wybranych triterpenów – np. glukozydu kwasu oleanolowego oraz glukozydu p-nitrofenolu). AH-aza z kolei wykazuje wyraźną specyficzność wobec acyloglukozydów steroli, natomiast nie hydrolizuje palmitynianu p-nitrofenolu, acylogliceroli oraz estrów steroli. GH-aza wykazuje wyższą aktywność w preparatach z korzeni i przy pH<7, podczas gdy w AH-aza w preparatach z części nadziemnych przy pH≥7. Oba enzymy są hamowane przez niektóre jony metali ciężkich (Hg2 , Zn2 ). Molekularna i katalityczna charakterystyka obu hydrolaz z bakłażana pozwoliła na znaczące powiększenie wiedzy o aparacie enzymatycznym zaangażowanym w metabolizm glukozydowych form steroli. W przypadku AH-azy jest to pierwsza charakterystyka tego enzymu.

 


logo HR