logo Uniwersytet Warszawski


Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Sylwii Kosmali-Grzechnik Drukuj
poniedziałek, 19 stycznia 2009 14:34

„Filogeneza i taksonomia wybranych grup gatunków klejnotek (Euglenaceae) na podstawie danych morfologicznych i molekularnych.”

Promotor:
prof. dr hab. Bożena Zakryś

Recenzenci:
prof. dr hab. Jerzy Dzik
prof. dr hab. Andrzej Witkowski

Praca doktorskawykonana wZakładzie Systematyki i Geografii Roślin, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

W ostatnim dziesięcioleciu notuje się na świecie bardzo intensywny rozwój badań taksonomicznych i filogenetycznych z wykorzystaniem technik molekularnych. Obiektem tych badań są praktycznie wszystkie grupy organizmów w tym również eugleniny, które wdrugiej połowie XX wieku cieszyły się stosunkowo niewielkim zainteresowaniem badaczy. Ten stan rzeczy uległ radykalnej zmianie, kiedy okazało się, że powstały one na drodze wtórnej endosymbiozy i podobnie jak inne glony takie jak: złotowiciowce, tobołki, okrzemki, różnowiciowce czy brunatnice nie powinny być dalej klasyfikowane w królestwie Plantae.

W efekcie intensyfikacji badań molekularnych euglenin, wyniki dotyczące filogenezy całej grupy można posumować następująco: (1) są one grupą monofiletyczną, spokrewnioną zheterotroficznymi wiciowcami z Kinetoplastida i Diplonemida (wspólna grupa Euglenozoa w obrębie królestwa Excavata); (2) eugleniny bezbarwne dzielą się na dwie grupy: pierwotnie i wtórnie heterotroficzne – niektóre gatunki z rodzajów Euglena (dawniej Khawkinea, Astasia) czy Phacus (dawniej Hyalophacus)utraciły chloroplasty; (3) eugleniny zielone iwtórnie heterotroficzne reprezentują jedną linię ewolucyjną, co dowodzi, że wtórna endosymbioza między heterotroficzną eugleniną a zielenicą, w wyniku której powstały chloroplasty współczesnych euglenin zielonych, miała miejsce tylko raz w toku ewolucji.

Coraz dokładniejsze drzewa filogenetyczne euglenin coraz lepiej obrazują stosunki pokrewieństwa w obrębie grupy. Na ich podstawie można prześledzić w jaki sposób ewoluowały te organizmy i wskazać cechy synapomorficzne, symplezjomorficzne lub cechy wynikające z konwergencji.

Uzyskiwane drzewa wskazują jednoznacznie, że tradycyjna klasyfikacja klejnotek, opierająca się na porównywaniu cech morfologicznych, nie odzwierciedla rzeczywistego pokrewieństwa pomiędzy taksonami. Niezbędne jest więc przeprowadzenie takich weryfikacji taksonomicznych, które doprowadzą do zgodności systemu klasyfikacji z filogenezą. Jednak bardzo poważnym utrudnieniem w interpretacji drzew filogenetycznych są nieprawidłowo opisane w literaturze gatunki, co jest powodem błędnej identyfikacji szczepów przetrzymywanych w kolekcjach kultur, a używanych do analiz. To powoduje, że szczepy reprezentujące teoretycznie ten sam gatunek lokują się w różnych gałęziach drzewa (często bardzo od siebie odległych).

Przyczyną takiej sytuacji jest m.in. fakt, że prowadzone od ponad 170 lat badania morfologiczne klejnotek nie doprowadziły dotychczas do zdefiniowania jednoznacznych kryteriów identyfikacji gatunków (a nawet rodzajów). Zaowocowało to opisaniem ponad 1000 taksonów (gatunków, odmian i form), których rozróżnianie w wielu przypadkach jest praktycznie niemożliwe (grupy gatunków krytycznych). Taka sytuacja stwarza duże trudności przy identyfikacji nawet najbardziej pospolitych taksonów, dlatego weryfikacja morfologicznych cech diagnostycznych staje się koniecznością, a zastosowanie technik molekularnych po raz pierwszy czyni ją możliwą. Porównawcze badania morfologiczno-molekularne umożliwiają bowiem określenie zmienności fenotypowej i genotypowej jednocześnie, co pozwala na identyfikację cech morfologicznych wynikających zkonwergencji i wyeliminowanie ich jako cech diagnostycznych. Jest to podstawą do uzupełnienia opisów diagnostycznych oraz wyznaczenia epitypów dla dobrze wyodrębnionych na drzewie kladów (rodzajów, gatunków), a właściwe kryteria morfologiczne i unikalne sekwencje nukleotydowe (ang. signature sequences) umożliwiają poprawną ich identyfikację. Badania tego typu zostały dotychczas przeprowadzone tylko dla dwóch grup gatunków krytycznych euglenin: grupy „Euglena agilis” i „E. myxocylindracea” .

Przedmiotem prezentowanych tutaj badań były cztery kolejne grupy gatunków („Lepocinclis spirogyroides”, „Monomorphina pyrum”, „Phacus orbicularis”, „Euglena viridis”) reprezentujące cztery różne rodzaje dobrze zróżnicowane pod względem morfologicznym.

Celem badań było (1) określenie zakresu zmienności morfologiczno-genetycznej oraz weryfikacja cech diagnostycznych taksonów zaliczanych do tych grup, (2) poznanie stosunków pokrewieństwa w obrębie każdej z badanych grup, (3) przeprowadzenie weryfikacji taksonomicznej połączonej z wyznaczeniem lektotypów, epitypów oraz uzupełnieniem opisów diagnostycznych gatunków (dobrze wyodrębnionych kladów) również o cechy molekularne (sekwencje unikalne).

Materiał do badań morfologiczno-molekularnych stanowiło 69 szczepów pochodzących ze światowych kolekcji kultur glonowych oraz wyizolowanych w Zakładzie Systematyki i Geografii Roślin UW. Reprezentowały one 18 taksonów (liczonych już po weryfikacji; 31 – przed weryfikacją), dla których uzyskano w sumie 54 sekwencje dwóch genów (16 sekwencji genu 16S rRNA oraz 38 sekwencji genu 18S rRNA) o łącznej długości około 100 000 par zasad. W analizach filogenetycznych wykorzystano łącznie 155 sekwencji nukleotydowych (54 sekwencji własnych, 101 sekwencji z Banku Genów) uzyskanych dla 117 szczepów reprezentujących 47 taksonów (liczonych po weryfikacji). Stosunki pokrewieństwa szacowano stosując cztery metody: największej parsymonii, łączenia sąsiadów, największej wiarygodności i analizy bayesowskiej.

W mikroskopie świetlnym (lub w mikroskopie konfokalnym) zbadano jakościowe i ilościowe cechy morfologiczne o znaczeniu diagnostycznym. Próbki do badań morfologicznych pobierano z każdej hodowli (szczepu) wielokrotnie, przez okres 12 tygodni, co umożliwiało prześledzenie zmienności cech w trakcie ontogenezy i w czasie zmieniających się warunków środowiskowych.

Przeprowadzone pomiary i obserwacje mikroskopowe wykazały pewien stały, różny dla różnych gatunków poziom między- i wewnątrzszczepowej zmienności morfologicznej zależny od etapu ontogenezy i stanu fizjologicznego osobników żyjących w młodych lub starzejących się hodowlach.Obserwowana zmienność dotyczyła chloroplastów (liczby, kształtu, położenia w komórce, obecności pirenoidów), materiału zapasowego (ziaren paramylonu), mukocyst (ciałek śluzowych położonych pod peryplastem), zdolności do tworzenia palmelli (nieruchliwych stadiów podziałowych), ornamentacji peryplastu, długości wici oraz wielkości, kształtu i barwy komórek. Zmienność odnotowano również na poziomie molekularnym – nie przekraczała ona 5% w obrębie gatunku, jednak nie zawsze znajdowała potwierdzenie w zmienności morfologicznej.

Konfrontacja danych morfologicznych z wynikami analiz filogenetycznych pozwoliła na przeprowadzenie weryfikacji taksonomicznej badanych grup gatunków krytycznych i w jej wyniku uznano na zasadne pozostawienie:

  1. w grupie „L. spirogyroides” dwóch gatunków (Lepocinclis spirogyroides iL.fusca) spośród 13 taksonów opisanych w literaturze (3 gatunków, 10odmian i form) oraz synonimizację pozostałych; za cechy diagnostyczne uznano kształt i wielkość komórek oraz ornamentację peryplastu (kształt papilli);oba gatunki nie są ze sobą blisko spokrewnione – nadrzewach filogenetycznych tworzą odrębne, monofiletyczne klady.
  2. w grupie „M. pyrum” – jednego gatunku (Monomorphina pyrum) spośród 20taksonów opisanych w literaturze (16 gatunków, 4odmian i form) isynonimizację pozostałych; M. pyrum jest reprezentowany przez zróżnicowane pod względem molekularnym i morfologicznym szczepy.
  3. w grupie „P. orbicularis” – trzech gatunków (Phacus pleuronectes, P.orbicularis iP.hamelii) spośród 30 taksonów opisanych w literaturze (14gatunków, 16odmian iform) oraz synonimizację pozostałych. Pierwszorzędową cechą diagnostyczną jest ornamentacja peryplastu (obecność lub brak poziomych rozpór pomiędzy podłużnymi prążkami); kształt iwielkość komórek są cechami drugorzędowymi; P. pleuronectes iP. orbicularis nie są ze sobą blisko spokrewnione – nadrzewach filogenetycznych tworzą odległe od siebie, monofiletyczne klady;
  4. w grupie „E. viridis” – sześciu gatunków (Euglena viridis, E. pseudoviridis, E.stellata, E. geniculata, E. chadefaudii, E. tristella) spośród 22 taksonów znanych zliteratury (11 gatunków oraz 11 odmian i form) i synonimizację pozostałych. Obecność i kształt mukocyst oraz liczba chloroplastów sącechami pierwszorzędowymi; kształt i wielkość komórek mają znaczenie drugorzędne. Stosunki pokrewieństwa pomiędzy tymi gatunkami nie są do końca wyjaśnione.

Ponadto:

  1. Uzupełniono opisy diagnostyczne (w tym o unikalne sekwencje nukleotydowe) oraz wyznaczono epitypy (lub lektotypy) dla zweryfikowanych gatunków.
  2. Uzupełniono opisy diagnostyczne (w tym o unikalne sekwencje nukleotydowe) dwóch rodzajów (Cryptoglena i Monomorphina).
  3. W oparciu o cechy molekularne (unikalne sekwencje nukleotydowe) opisano trzy nowe dla nauki taksony: Monomorphina pseudopyrum sp. nov.,Euglena pseudostellata sp. nov.iEuglena pseudochadefaudii sp. nov.
  4. Zweryfikowano oznaczenia 45szczepów euglenin znajdujących się w światowych kolekcjach kultur glonowych.

Wyniki prezentowane w niniejszej pracy weszły w skład następujących publikacji:

  • Kosmala, S., Karnkowska, A., Milanowski, R., Kwiatowski, J. i Zakryś, B. 2009. Phylogeny and systematics of the species from the genus Euglena (Euglenaceae) with axial, stellate chloroplasts based on morphological and molecular data. J. Phycol.45:(w druku)
  • Kosmala, S., Bereza, M., Milanowski, R., Kwiatowski, J. i Zakryś, B. 2007. Morphological and molecular examination of relationships and epitype establishment of Phacus pleuronectes, Phacus orbicularis and Phacus hamelii. J. Phycol. 43: 1071-82.
  • Kosmala, S., Milanowski, R., Brzóska, K., Pękala, M., Kwiatowski, J. i Zakryś. B. 2007. Phylogeny and systematics of the genus Monomorphina (Euglenaceae) based on cytoplasmic SSU sequence analysis. J. Phycol. 43: 171-85.
  • Kosmala, S., Karnkowska, A., Milanowski, R., Kwiatowski, J. i Zakryś. B. 2005. The phylogenetic and taxonomic position of Lepocinclis fusca comb. nova (=Euglena fusca) (Euglenaceae). Morphological and molecular justification. J. Phycol. 41: 1258-67.
 


logo HR