logo Uniwersytet Warszawski


Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Michała Małeckiego Drukuj
poniedziałek, 01 grudnia 2008 13:19

„Charakterystyka aktywności enzymatycznej kompleksu mitochondrialnego degradosomu Saccharomyces cerevisiae i jego podjednostek.”

Promotor:

dr hab. Paweł Golik

Recenzenci:
prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn 

prof. dr hab. Krzysztof Staroń

Praca doktorska wykonana w Instytucie Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

Drożdżowy degradosom mitochondrialny (mtEXO) jest głównym kompleksem białkowym zaangażowanym w degradację RNA w mitochondriach S. cerevisiae. Kompleks składa się z dwóch podjednostek: egzonukleazy kodowanej przez jądrowy gen DSS1 oraz helikazy kodowanej przez jądrowy gen SUV3. Dss1p należy do egzonukleaz z rodziny RNR (wykazują podobieństwo do sekwencji bakteryjnej RNazyII), helikaza Suv3p zawiera motywy charakterystyczne dla szeroko rozpowszechnionej grupy helikaz z rodziny DExH/D-box. Kooperacja tych dwu typów enzymów pojawia się często w systemach degradacji RNA (takich jak bakteryjny degradosom czy egzosom u Eukariota). Kompleksy białkowe przeprowadzające proces degradacji RNA w innych organizmach (lub innych kompartmentach komórkowych) są jednak dużo bardziej skomplikowane. Skład drożdżowego degradosomu wydaje się ograniczony do najbardziej kluczowych w degradacji enzymów. Prosta budowa sprawia, że drożdżowy degradosom mitochondrialny jest świetnym modelem do badanie natury kooperacji między egzonukleazą a helikazą w procesie degradacji RNA.

Białka kompleksu wyrażono heterologicznie w bakteriach, następnie metodą chromatografii powinowactwa i sączenia molekularnego oczyszczono duże ilości pojedynczych komponentów oraz cały kompleks degradosomu. Preparatów oczyszczonych białek używano do oznaczeń aktywności trawienia RNA, aktywności hydrolizy ATP oraz aktywności helikazowej pojedynczych białek i rekonstytuowanego kompleksu degradosomu.

Otrzymane wyniki wskazują na bardzo ścisłe zależności między oboma białkami kompleksu. W przypadku każdej z badanych aktywności zauważono znaczne różnice między wynikami otrzymywanymi przy badaniu poszczególnych komponentów a wynikami otrzymywanymi przy badaniu aktywności całego kompleksu.

Aktywność hydrolizy ATP białka Suv3 jest stymulowana przez obecność RNA, w obecności kwasu nukleinowego aktywność ta dla białka Suv3 oraz kompleksu degradosomu jest podobna. Niespecyficzna aktywność hydrolizy ATP, którą helikaza Suv3p wykazuje bez RNA w środowisku reakcji znacznie maleje jeśli białko wchodzi w skład kompleksu.

Białko Suv3 nie wykazuje aktywności helikazowej poza kompleksem degradosomu, jednak w kompleksie Suv3p jest aktywną helikazą zdolną do rozplatania dupleksów RNA/RNA, RNA/DNA oraz DNA/DNA. Wykazano także, że najefektywniej rozplatane są dupleksy z jednoniciowym odcinkiem 3'.

Białko Dss1 poza kompleksem degradosomu wykazuje słabą aktywność egzonukleolitczną niezależną od obecności ATP, kiedy Dss1p występuje w kompleksie z helikazą Suv3p prędkość maksymalna reakcji trawienia RNA wzrasta około dziesięciokrotnie, ponadto reakcja staje się prawie całkowicie ATP zależna. Efekt nie jest związany z występowaniem w substracie RNA struktur drugorzędowych.

Na podstawie otrzymanych wyników zaproponowano model działania kompleksu degradosomu. W modelu zakłada się, że helikaza Suv3 hydrolizując ATP aktywnie przesuwa się po pojedynczej nici RNA, przesuwanie to powoduje podawanie substratu do centrum aktywnego egzonukleazy Dss1p. Aktywność helikazowa poprzedza więc zawsze aktywność egzonukleazową. W przypadku braku ATP w środowisku reakcji tempo trawienia RNA przez kompleks degradosomu spada prawie do zera, w takim układzie Suv3 nie przesuwa się po RNA, jednak pozostaje związany z substratem, powoduje to automatycznie zablokowanie dostępności RNA dla egzonukleazy. Zasadność zaproponowanego modelu potwierdzono analizując aktywności kompleksów zawierających zmutowane pod względem aktywności hydrolizy ATP wersje białka Suv3. Kompleksy takie miały znacznie zaburzoną zdolność degradacji RNA niezależnie od występowania w substracie struktur drugorzędowych.

Podczas wykonywania pracy prowadzono także próby uzyskania preparatów kompleksu odpowiednich do krystalizacji. Otrzymanie struktury kryształów kompleksu ostatecznie odpowiedziałoby na pytanie o mechanizm kooperacji podjednostek. Jak do tej pory próby takie nie powiodły się.

Część otrzymanych podczas wykonywania pracy wyników weszła w skład publikacji:

  1.  Malecki M, Jedrzejczak R, Stepien PP, Golik P; “In vitro Reconstitution and Characterization of the Yeast Mitochondrial Degradosome Complex Unravels Tight Functional Interdependence.” J Mol Biol. 2007 Sep 7;372(1):23-36.
  2. Michal Malecki, Robert Jedrzejczak, Olga Puchta, Piotr P. Stepien, and Pawel Golik "In Vivo and In Vitro Approaches for Studying the Yeast Mitochondrial RNA Degradosome Complex" Methods in Enzymology, 2008 Volume 447
 


logo HR