logo Uniwersytet Warszawski


Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Marty Sochackiej-Piętal Drukuj
poniedziałek, 24 listopada 2008 16:14

„Identyfikacja i charakterystyka elementów transpozycyjnych Paracoccus pantotrophus”

Promotor:
dr hab. Dariusz Bartosik

Recenzenci:
dr hab. Jacek Bielecki, prof. UW prof.
dr hab. Grzegorz Węgrzyn

Praca doktorska wykonana w Zakładzie Genetyki Bakterii Instytutu Mikrobiologii Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Analizy porównawcze sekwencji nukleotydowych wielu genomów bakteryjnych pozwoliły zaobserwować, iż genomy te nie są statycznymi, monolitycznymi strukturami, lecz ulegają nieustannym zmianom. Ich plastyczność uwarunkowana jest w dużej mierze obecnością elementów transpozycyjnych (TE), które powszechnie występują u bakterii. Procesy transpozycji są zwykle powiązane z wytworzeniem zmian strukturalnych w DNA, prowadzących do powstania mutacji insercyjnych, delecji, inwersji oraz translokacji, co może pociągać za sobą różne efekty fenotypowe. Elementy te, uważane za najbardziej rekombinogenny czynnik genomów bakteryjnych, odgrywają zatem istotną rolę w zwiększaniu zmienności, a tym samym zdolności adaptacyjnych i ewolucyjnych ich gospodarzy.

Celem niniejszej pracy była identyfikacja i kompleksowa analiza funkcjonalnych TE występujących w  czterech szczepach Paracoccus pantotrophus (Alphaproteobacteria). Zainteresowanie tymi bakteriami wynika z ich niebywałej różnorodności fizjologicznej, która może być potencjalnie związana z występowaniem licznych TE.

Do identyfikacji TE zastosowano trzy odmienne strategie eksperymentalne. Każda z nich wymagała użycia innego wektora pułapkowego (ang. entrapment vector). Metody te bazowały na wykorzystaniu: (i) kasety selekcyjnej cI-tetA, umożliwiającej bezpośrednią selekcję klonów niosących zmutowane plazmidy insercyjne, (ii) kasety z genem reporterowym, umożliwiającej identyfikację elementów mogących zapewnić transkrypcję sąsiadujących genów oraz (iii) plazmidu samobójczego, który pozwalał na wyselekcjonowanie kointegratów generowanych przez TE podczas transpozycji replikacyjnej. Wektory te pozwoliły na „sklonowanie” in vivo w pełni funkcjonalnych TE, co ma istotne znaczenie aplikacyjne, bowiem elementy te mogą byćwykorzystane do konstrukcji nowych narzędzi umożliwiających przeprowadzenie mutagenezy transpozonowej w bakteriach z klasy Alphaproteobacteria.

W wyniku przeprowadzonych badań wykryto, nieopisane wcześniej,: (i) cztery sekwencje insercyjne (IS), (ii) dwa transpozony niezłożone oraz (iii) element  o mozaikowej strukturze, który oznaczono jako TnPpa1. Wyznaczono częstość transpozycji tych elementów (w zakresie 10-3-10-6) oraz odczytano ich sekwencje nukleotydowe.

Analizy in silico uzyskanych sekwencji umożliwiły poznanie struktury genetycznej wykrytych TE, w tym wyróżnienie: (i) terminalnych powtórzonych sekwencji, (ii) genów kodujących transpozazy, (iii) konserwowanych motywów DDE transpozaz, a także (iv) sekwencji docelowej transpozycji. Dzięki uzyskanym danym przeprowadzono kompleksowe analizy porównawcze, co pozwoliło na przypisanie poszczególnych elementów do odpowiedniej rodziny [w przypadku IS - rodziny: IS66,IS5 (grupa IS427 oraz grupa IS903) oraz IS6].

Dwa, zidentyfikowane w tej pracy, transpozony (Tn3434 i Tn5393) reprezentują rodzinę Tn3. Pierwszy z nich jest elementem kryptycznym, który, podobnie jak IS, niesie wyłącznie informację genetyczną niezbędną do własnej transpozycji (zawiera moduł transpozazy i resolwazy); drugi zaś to Tn5393 niosący geny oporności na streptomycynę. Identyfikacja Tn5393 w izolacie P. pantotrophuswskazuje, iż bakterie glebowe mogą stanowić istotny rezerwuar determinant oporności na antybiotyki w środowisku.

Największy z poznanych elementów jest transpozycyjną wyspą genomową TnPpa1 (44,3 kpz) o unikatowej, mozaikowej strukturze. Rdzeń TnPpa1 stanowią geny konserwowane w chromosomach wielu bakterii (w tym różnego typu transportery i  geny metabolizmu podstawowego), zaś jego aparat transpozycyjny składa się z dwóch, ułożonych skrajnie, kopii transpozonu niezłożonego Tn3434. Przeprowadzone eksperymenty wskazują, że TnPpa1 został wprowadzony do macierzystego szczepu (DSM 11072) w wyniku horyzontalnego transferu genów. Identyfikacja tego elementustanowi dowód mobilności segmentów DNA pochodzenia chromosomowego, warunkowanej przez elementy transpozycyjne. Transpozycja tych segmentów do współrezydujących plazmidów lub megaplazmidów może wywierać piętno na strukturę i ewolucję genomów bakteryjnych (np. może stymulować wytwarzanie genomów wielochromosomowych). Ponadto sugeruje się, iż duplikacja materiału genetycznego (np. poprzez transpozycję replikacyjną), a następnie jego różnicowanie, jest jednym z ważniejszych czynników wpływających na tempo ewolucji bakterii. Warto dodać, że TnPpa1 jest pierwszym elementem tego typu, który zidentyfikowano w wyniku odpowiednio przeprowadzonej selekcji zdarzenia transpozycyjnego. W tym przypadku mobilność tego elementu nie budzi więc żadnych wątpliwości.

W końcowej części pracy przeprowadzono analizy hybrydyzacyjne, które pozwoliły ustalić liczbę kopii poszczególnych TE w genomie gospodarza oraz poznać ich lokalizację (plazmid/chromosom). Zbadano również rozpowszechnienie wykrytych TE w genomach innych bakterii, co dało wyobrażenie o częstości i kierunkach transferu horyzontalnego genów w Paracoccus spp. Przeprowadzono również komputerowe analizy filogenetyczne, które wykazały m.in., że elementy pokrewne Tn5393 występują zarówno w bakteriach zaliczanych do typu Proteobacteria (klasy Alphaproteobacteria i Gammaproteobacteria), jak również do typu Actinobacteria. Obecność tych transpozonów w Actinobacteria jest dowodem na, dość rzadko obserwowany, transfer horyzontalny genów między bakteriami gramujemnymi a gramdodatnimi.

 


logo HR