logo Uniwersytet Warszawski


Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Katarzyny Bocian Drukuj
środa, 19 listopada 2008 13:03

„Rola indukowanej immunosupresji w powstawaniu i funkcji limfocytów Treg”

Praca doktorska wykonana w Zakładzie Immunologii, Instytutu Zoologii,·Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski.

Autor:
Katarzyna Bocian

Promotor:
prof. dr hab. Grażyna Korczak-Kowalska

Recenzenci:
Dr hab. Maria Doligalska, prof. UW (Zakład Parazytologii, Wydział Biologii UW)
Prof. dr hab. Marek Jakóbisiak (Zakład Immunologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny)

Stosowane w transplantologii leki immunosupresyjne hamują odpowiedź układu odpornościowego biorcy na obcą tkankę i umożliwiają funkcjonowanie przeszczepionego narządu. Działają jednak niespecyficznie i stosowane długoterminowo toksycznie. W organizmie pacjenta powstaje niedobór odporności, wynikiem czego są liczne infekcje i choroby nowotworowe oraz postępująca niewydolność narządów przeszczepionych.

Obecnie, intensywnie poszukiwane są terapie nietoksyczne, swoiste antygenowo i pozwalające indukować oraz utrzymać tolerancję transplantacyjną na antygeny dawcy. Bardzo obiecujące wydają się komórki układu odpornościowego wykazujące właściwości supresyjne, określane jako limfocyty T regulatorowe CD4 CD25 (Treg CD4 CD25 ). Naturalne komórki regulatorowe (nTreg) powstają w grasicy, natomiast na obwodzie mogą powstawać indukowane (iTreg). Obserwacja ta otworzyła możliwość ich terapeutycznego zastosowania. Komórki regulatorowe mogą hamować aktywację limfocytów T stymulowanych antygenami przeszczepu, głównie ich proliferację i produkcję cytokin, a tym samym wpływać na tolerowanie przeszczepionej tkanki.

Stosowana farmakologiczna immunosupresja hamuje aktywację limfocytów T CD4 kluczowych dla procesu odrzucania. Limfocyty T CD4 są również populacją komórek, która może być źródłem indukowanych limfocytów Treg CD4 CD25. Ukazujące się doniesienia sugerują,· że niektóre leki immunosupresyjne mogą sprzyjać wykorzystaniu potencjału supresyjnego limfocytów Treg CD4 CD25. Faktyczne wykorzystanie działających antygenowo swoiście limfocytów Treg CD4 CD25 z odpowiednio powiązaną terapią immunosupresyjną mogłoby doprowadzić do powstawania tolerancji transplantacyjnej.

Wykorzystane w pracy, powszechnie stosowane w klinice, czynniki immunosupresyjne różniły się mechanizmem działania: inhibitor kalcyneuryny (cyklosporyna A) hamuje syntezę cytokin w tym IL-2, blokowanie kinazy mTOR (rapamycyna) zatrzymuje cykl komórkowy w fazie G1.

Postawiono hipotezę, że inhibitor kalcyneuryny będzie w większym stopniu niż bloker kinazy mTOR hamował powstawanie oraz funkcję Treg CD4 CD25 człowieka podczas stymulacji alloantygenami w mieszanej hodowli leukocytów. W celu zweryfikowania postawionej hipotezy przeprowadzono następujące badania, które pozwoliły:

I Określić wpływ różnych stosowanych terapii immunosupresyjnych (zawierających, inhibitor kalcyneuryny, cyklosporynę A lub bloker mTOR, rapamycynę) .na odsetek populacji limfocytów Treg w krwi obwodowej pacjentów po przeszczepieniu nerki.

II Określić wpływ wybranych mechanizmów immunosupresji na poziom oraz funkcję limfocytów Treg CD4 CD25 w mieszanej hodowli leukocytów (MLR: mixed leukocyte reaction) oraz udział cytokin IL-10 i TGF-β1 w powstawaniu i pełnieniu funkcji supresyjnych limfocytów Treg CD4 CD25.

Populację limfocytów Treg ( 2-3 % limfocytw CD4 ) identyfikowano na podstawie charakterystycznego profilu ekspresji cząsteczek zewnątrzkomórkowych: CD4, CD25, CTLA-4, CD122, GITR i wewnątrzkomórkowo czynnika transkrypcyjnego FOXP3. Przedstawione białka związane są z powstawaniem i funkcją supresyjną badanych komórek.

Otrzymane wyniki pozwoliły stwierdzić, że terapia immunosupresyjna wykorzystująca inhibitor kalcyneuryny istotnie obniżała odsetek limfocytów T CD4 wykazujących wysoką ekspresję markera CD25 (CD25h) i obecność cząsteczek CTLA4, CD122 i FOXP3, w krwi obwodowej pacjentów po transplantacji nerki w porównaniu do chorych otrzymujących rapamycynę oraz osób zdrowych. Nie stwierdzono istotnych różnic w analizie odsetka limfocytów CD4 CD25h,CD4 CD25hCTLA4 , CD4 CD25hCD122 ,· CD4 CD25hFOXP3 pomiędzy grupą chorych ze stabilną funkcją przeszczepu, a przewlekle odrzucających przeszczep.

Wykazano, że indukowane w MLR limfocyty Treg hamują proliferację leukocytów aktywowanych alloantygenami, potwierdzając tym samym działanie supresyjne komórek powstających·in vitro. Następnie badania przeprowadzone z udziałem czynników immunosupresyjnych, potwierdziły obserwacje kliniczne, obecność inhibitora kalcyneuryny powodowała silniejsze hamowanie odsetka powstających limfocytów Treg niż blokowanie kinazy mTOR.

Wykazano również, że gęstość białka FOXP3, odpowiedzialnego za właściwości supresyjne, utrzymywała się na podobnym poziomie we wszystkich badanych wariantach lecz ·najniższy odsetek limfocytów Treg FOXP3 ze zidentyfikowaną ekspresją receptora GITR - negatywnie regulującego funkcje supresyjne limfocytów Treg, występował w przypadku blokowania kinazy mTOR. Ostatecznie potwierdzono, że limfocyty Treg indukowane w obecności rapamycyny miały większy potencjał supresyjny w porównaniu do limfocytów Treg izolowanych ze środowiska z cyklosporyną A lub hodowli kontrolnej. Wykazywana funkcja supresyjna związana była ze wzrostem stężenia TGF-β1, który jest niezbędny do powstawania i funkcjonowania limfocytów Treg .

Podsumowując, uzyskane wyniki potwierdziły postawioną hipotezę oraz wskazały rapamycynę jako obiecującą możliwość skojarzenia limfocytów Treg CD4 CD25 z terapią immunosupresyjną. Indukowane w organizmie lub·in vitro i przeniesione do biorcy, allospecyficzne limfocyty Treg CD4 CD25 mogłyby pełnić funkcje supresyjne wspierając zminimalizowaną (dzięki temu mniej toksyczną) farmakologiczną terapię immunosupresyjną.

 


logo HR