Replikacja

Replikacja mtDNA zachodzi w matriks mitochondrialnej i jest niezależna od faz cyklu komórkowego i replikacji jądrowego DNA (nDNA). Mechanizm replikacji mtDNA ssaków nadal pozostaje niejasny, a różne proponowane modele budzą wiele kontrowersji.

Model asynchroniczny

Zaproponowany przez Claytona model asynchroniczny zwany również modelem wyparcia nici jest najstarszy i najbardziej rozpowszechniony. Według niego
w trakcie powielania mtDNA wykorzystywane są dwa niezależne miejsc startu replikacji. Synteza nici ciężkiej rozpoczyna się w miejscu OH (ori H), położonego poniżej miejsca startu transkrypcji nici lekkiej LSP (ang. light-strand promoter) w obszarze pętli D, biegnie wzdłuż nici L, aż do wytworzenia potomnej nici H. Kiedy replikacja nici H dotrze do miejsca OL, macierzysta nić H jest wypierana i dochodzi do odsłonięcia miejsca startu replikacji nici L. Następuje początek syntezy nici L, zachodzącej w przeciwnym kierunku niż replikacja nici H, aż do wytworzenia potomnej nici lekkiej.

Inicjacja replikacji nici H wymaga obecności krótkich starterów RNA. Powstają one na skutek obróbki transkryptu sekwencji promotorowej nici L.
W konsekwencji replikacja mtDNA jest powiązana i zależna od transkrypcji zachodzącej w mitochondriach. Proces inicjacji replikacji składa się z kilku etapów. Na początku mitochondrialna polimeraza RNA rozpoczyna transkrypcję z miejsca promotorowego nici L produkując tym samym prekursor startera wykorzystywanego w procesie replikacji. Nowo zsyntetyzowana nić RNA pozostaje połączona z odcinkiem DNA powyżej miejsca OH, zawierającym sekwencje CSB. W ten sposób utworzona zostaje stabilna struktura zwana pętlą R.
Replikacja

RNaza MRP tnie prekursor startera RNA wewnątrz lub wokół pętli R tworząc dojrzały starter.
Mitochondrialna polimeraza DNA, nazywana również polimerazą γ, rozpoczyna replikację nici H poprzez wydłużanie startera. Replikacja nici H może zostać zatrzymana w obrębie sekwencji TAS z wytworzeniem struktury pętli D, lub zachodzić na całej długości genomu.
Miejsce startu replikacji nici L (OL) znajduje się w znacznej odległości od miejsca OH. Położone jest ono wewnątrz małego regionu niekodującego. Aby mogło dojść do replikacji nici L, miejsce OL musi zostać wyeksponowane w postaci jednoniciowej.

Inicjacja replikacji wymaga działania specyficznej prymazy zdolnej do syntezy krótkiego odcinka RNA, którego koniec 5’ znajduje się w rejonie pętli bogatym w T. Replikacja nici L zachodzi wokół całej długości genomu mitochondrialnego . Po zakończeniu replikacji obu nici, potomna cząsteczka mtDNA jest odłączana od matrycy, startery RNA są usuwane, luki wypełniane, a wolne końce ligowane. Ostatecznie zamknięta, kulista cząsteczka mtDNA oddziałuje z odpowiednimi białkami, a wprowadzenie superhelis umożliwia przyjęcie właściwej struktury. Obecnie wiadomo, że model przedstawiony przez Claytona jest nieaktualny.

Model RITOLS (ang. ribonucleotide incorporation throughout the lagging strand) jest najnowszym proponowanym mechanizmem replikacji, jednak posiada on cechy wspólne z modelem asynchronicznym. Oba zakładają, że miejsce startu replikacji znajduje się w punkcie OH lub w pobliżu niego. Zgodne są również co do istnienia znacznego opóźnienia pomiędzy syntezą nici ciężkiej i lekkiej. Najistotniejszą kwestią różniącą oba modele jest istnienie dużych, jednoniciowych fragmentów DNA. Sekwencje, które według replikacji asynchronicznej występują w postaci jednoniciowej, według RITOLS są pokryte RNA.
RNA pokrywające macierzystą nić H w trakcie syntezy nici ciężkiej może być produkowany przez nieznaną dotąd prymazę. Alternatywny mechanizm zakłada, że fragmenty RNA pokrywające nić opóźnioną przyłączane są na skutek hybrydyzacji wypartej nici i nowopowstającego RNA. W tym „modelu sznurowadła” (ang. bootlace model) zsyntetyzowany uprzednio transkrypt jest „nawlekany” przez przesuwający się kompleks polimerazy DNA i hybrydyzowany wzdłuż wypartej nici H w kierunku 3’5’. Część jednoniciowych produktów pośrednich replikacji pokrytych jest w całości przez RNA, jednak większość z nich jest mieszaniną fragmentów RNA i DNA. Najprościej wytłumaczyć ten fakt można zakładając, że nić opóźniona powstaje jako RNA, a następnie zamieniana jest na DNA w procesie dojrzewania. Najprawdopodobniej miejscem inicjacji dojrzewania jest OL, które według modelu asynchronicznego jest miejscem inicjacji replikacji
nici L.

Model COSCOFA

Dr Ian Holt i współpracownicy zaproponowali alternatywny mechanizm replikacji
mtDNA, oparty na obserwacjach produktów pośrednich replikacji poddanych elektroforezie na dwuwymiarowych żelach agarozowych. Według modelu COSCOFA (ang. conventional strand-coupled Okazaki-fragment associating) replikacja obu nici rozpoczyna się w strefie inicjacji replikacji (Ori Z) i zachodzi synchronicznie wokół cząsteczki mtDNA. Nić ciężka syntetyzowana jest w sposób ciągły, a nić lekka powielana jest w sposób nieciągły, w postaci fragmentów Okazaki, w miarę przesuwania się widełek replikacyjnych. Zakłada się, że w komórkach utrzymujących stałą liczbę cząsteczek mtDNA dominuje replikacja według modelu wyparcia nici. Natomiast replikacja według modelu synchronicznego odgrywa istotna rolę w sytuacji częściowej utraty materiału genetycznego (zmniejszenie liczby kopi mitochondrialnego DNA) i służy do gwałtownego namnożenia i przywrócenia odpowiedniej liczby cząsteczek mtDNA.
Replikacja
Składniki aparatu replikacyjnego

Mimo, że mechanizm replikacji mitochondrialnego DNA nadal pozostaje niejasny, zidentyfikowano kluczowe białka uczestniczące w tym procesie. Mitochondrialna polimeraza γ (pol γ) jest złożona z podjednostki katalitycznej pol γ α (140 kDa) i podjednostki kofaktorowej pol γ β (55 kDa), która pełni funkcję czynnika wiążącego DNA zwiększając powinowactwo do matrycy. Holoenzym działa jako heterotrimer α β2. Podjednostka katalityczna jest kodowana przez jądrowy (15q25) gen POLG, złożony z 23 eksonów. Produktem ekspresji tego genu jest polipeptyd zbudowany z 1239 aminokwasów, zawierający 3 sąsiadujące ze sobą domeny: domenę egzonukleolityczną o właściwościach korekcyjnych 5’3’ (aminokwasy 1-417), domenę łącznikową (aminokwasy 418-755) oraz domenę polimerazową (418-1239). Podjednostka kofaktorowa kodowana jest przez jądrowy gen POLG2 na chromosomie 17q. Polimeraza γ charakteryzuje się wysokim stopniem wierności (poniżej 2x10-6 błędów na nukleotyd) i jest relatywnie dokładna przy krótkich powtórzonych sekwencjach, jednak powielanie dłuższych homopolimerycznych ciągów (powyżej 4 bp) prowadzi do tzw. ślizgania się polimerazy. Tak jak i polimeraza jądrowa, polimeraza γ wymaga do prawidłowego funkcjonowania współdziałania wielu dodatkowych czynników. Niestety, do tej pory udało się scharakteryzować tylko ich niewielką część. Jednym z poznanych czynników jest zależna od ATP helikaza Twinkle (gen C10orf2), która rozwija podwójną helisę tworząc widełki replikacyjne. Prawdopodobnie ma ona postać pierścienia przesuwającego się wzdłuż mtDNA. Jest ona homologiem helikazy faga T7. Stwierdzono również bliski związek między mitochondrialnym czynnikiem transkrypcyjnym A (mtTFA), a poziomem mtDNA. Istnieje podejrzenie, że mtTFA pełni również funkcję białka opiekuńczego i wiążąc się z mtDNA chroni je przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Działanie czynników regulujących replikacje jest słabo poznane. Jak dotąd zidentyfikowano jądrowy czynnik oddechowy NRF-1 (ang. nuclear respiratory factor-1), będący czynnikiem transkrypcyjnym regulującym ekspresję wielu białek mitochondrialnych. Udowodniono, że NRF-1 wiąże się z regionami promotorowymi POLG, POLG2 oraz mtTFA.